
硫黃素T (Thioflavin T) 是一種熒光染料,可以和富含β折疊的結構結合,例如α-突觸核蛋白原纖維。一旦結合,硫黃素T的發射光譜就會發生紅移 ,并且熒光強度會增強,這是一個很好的用來檢測原纖維形成的測試。
? 用蒸餾水制備1mM硫黃素T儲備溶液 (新鮮制備并使用0.2μm 注射器過濾器過濾)
? 用PBS pH 7.4稀釋硫黃素T,確保每個孔中的硫黃素T最終濃度為25μM(每孔溶液體積=100μL). 孔板: Lumox96多孔孔板 (Sarstedt Catalog # 94.6000.024)
? 在將要使用之前才把alpha突觸核蛋白小份在室溫下解凍
? 在相應的孔中加入10μM 前體原纖維或者100μM 單體 (或兩者都有). 用移液器將孔中液體上下吸入排出混合. 濃度為估計值,需要優化來得到好的信號,并避免浪費
? 在密封孔板然后置于震蕩孵育器中 (600rpm),37°C孵育
? 用Molecular Devices Gemini XPS微孔板讀板機讀取熒光讀數,使用軟件是Softmax Pro版本為6.5.1
溫度:37°C
讀取形式:孔板掃描
波長:激發光450nm,發射光485nm
PMT增益:自動
閃光每讀:6
震蕩:讀數前20秒
? 再次密封孔板置于震蕩孵育器下37°C
? 1到72小時常規區間讀數
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